冷凍保護劑添加了冷凍保護劑的凍存液，一般都是高滲透壓的。當(dāng)細胞從生理溶液轉(zhuǎn)移到低溫保存溶液時，由于胞外溶液中的滲透壓較高，細胞會脫水，同時低溫保存溶液的小分子擴散到細胞內(nèi)時，細胞體積會緩慢減少；如果冷凍保存液中只有非穿透性冷凍保護劑(如葡聚糖和蔗糖)，細胞也會脫水并保持脫水狀態(tài)，只是冷凍保護劑不能進入細胞內(nèi)。在解凍復(fù)蘇階段，水從細胞外的低滲溶液迅速移動到細胞內(nèi)的高滲透溶液，而小分子冷凍保護劑則向相反的方向緩慢移動，導(dǎo)致細胞體積膨脹，并達到細胞內(nèi)外的滲透壓恢復(fù)平衡。所以，在細胞冷凍處理和解凍復(fù)蘇的過程中，稍有差錯，細胞就會因為滲透壓的過度變化，導(dǎo)致細胞膜破裂而死亡。這就是細胞的滲透壓力性損傷。

　　細胞凍存和復(fù)蘇采取“慢凍快融”的原則，慢速冷凍可使細胞內(nèi)的水份滲出細胞外，減少細胞內(nèi)形成冰晶的機會，快融以保證細胞外結(jié)晶快速融化，避免慢速融化水份滲入細胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)冰晶造成對細胞的損傷。

　　(一)細胞凍存

　　配制含10%DMSO或甘油的細胞凍存液，4℃預(yù)冷(新鮮配制的凍存液會產(chǎn)生大量的熱)；

　　取對數(shù)生長期的細胞，用細胞消化酶將單層生長的細胞消化下來；懸浮細胞則直接將細胞收集到離心管中；

　　離心1200rpm，6 min；

　　去除上清液，逐漸加入適量預(yù)冷的細胞凍存液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中的細胞終濃度為5×10e6/ml~1×10e7/ml；

　　將細胞分裝入凍存管中，每管1~1.5ml；

　　在凍存管上標(biāo)明細胞的名稱、凍存時間及操作人員姓名；

　　凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/min；到達-80℃時，則可迅速放入液氮中。

　　(二)細胞復(fù)蘇

　　佩戴眼鏡和手套，從液氮中取出凍存的細胞管。

　　迅速放入38℃水浴中，并不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其*融化，然后在無菌條件下取出細胞。

　　1200rpm/min離心5-10min，棄去上清，加入適量培養(yǎng)液混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，次日更換一次培養(yǎng)液。

　　解凍后洗滌是去除冷凍保護劑最常見的方法，即對細胞進行洗滌液或培養(yǎng)液重懸后離心，去除上清液，然后將細胞重新懸浮在洗滌液或培養(yǎng)液中。然而，需要注意的是，解凍后洗滌會造成凍存細胞的數(shù)量損失。